肺特异性间充质在肺发育和疾病中起着至关重要的作用，但通过定向分化产生肺特异性间充质的研究明显滞后。
今天小学社给大家带来一篇高分定向分化肺特异性间充质的研究。本文细胞的模型建立到类器官验证分析，条理清晰步骤详细，一气呵成。这份研究成果一定会给您带来全新的学习收获，为相关研究提供思路。对肺特异性间充质定向分化感兴趣的小伙伴快快学起来！
肺间质在肺部发育和疾病中发挥着重要作用。尽管一些小鼠模型研究已经帮助确定了可能参与肺间充质规范和分化的关键调控因子，但目前人们对小鼠早期肺间质的规范和分化的了解仍然有限，并且肺间质在人类发育过程中的调控机制尚不清楚。
(相关资料图)
为了弥补这一知识空白，本文的研究人员生成了一种携带肺特异性间质报告基因/系谱示踪剂的小鼠诱导多能干细胞(iPSC)系。通过这个模型，研究人员确定了调节指定肺间质所必需的途径（维甲酸和音猬因子，即RA和Shh），并发现小鼠iPSC衍生的肺间质(iLM)表达了原始发育肺间质的关键分子和功能特征。共培养实验还表明，肺上皮祖细胞的产量受到肺间质的影响，并且影响了上皮和间质的分化过程，这说明两者之间存在功能性相互作用。因此，本研究开发的iPSC群体为研究肺发育、疾病建模和开发疗法提供了丰富可持续的细胞来源。
分离上皮和间充质祖细胞
建立小鼠诱导多能干细胞(iPSC)/胚胎干细胞(ESC)系
诱导多能干细胞定向分化为肺间质
肺间质定向分化为更成熟的间质谱系
工程化肺上皮细胞和间质细胞的共培养
生成类器官评估iLM祖细胞的功能能力
肺间充质可以通过定向分化在体外产生
为了开发一种能够跟踪和量化早期肺间质，获取假定的肺间质特异性体外荧光报告/示踪系统，研究人员试图从改造过的小鼠中生成一个iPSC系。为了确保这些小鼠原始肺间质的特异性和可见性，研究人员给小鼠注射多西环素并观察发育中的原始肺间质在E10处的GFP荧光。接着重新编程小鼠的尾尖成纤维细胞生成具有正常核型并表达多能性标记的iPSC，并分化为侧板中胚层来测试它们的间充质能力，发现RA和Hedgehog (Hh)信号是有效激活Tbx4-LER所需的最小组合，而成功的肺间质分化需要内源性Wnt信号激活。
为了研究RA和Hh信号对肺间质分化的影响差异，研究人员确定了最佳的RA和PMA浓度，并发现RA和Hh信号通路共同促进肺间质分化以及KDR+侧板中胚层细胞是Tbx4-LERGFP+肺间质的前体细胞。进一步研究表明一部分肺间质细胞成功通过共同发育获得，而侧板中胚层祖细胞定向分化的肺效率明显更高。因此，该研究的重点放在了通过中胚层祖细胞定向分化肺间质的研究上（图1）。
图1
诱导的肺间质表达多个肺间质标志物
研究利用scRNA-seq 比较了中胚层祖细胞定向分化为肺间充质过程中的Tbx4-LERGFP+细胞（iLM）和Tbx4-LERGFP-细胞（iLM Neg）的分子表型，并与原代小鼠胚胎肺间质细胞进行了比较。通过聚类分析发现iPSC衍生的细胞可以划分为两个主要的簇，一个主要由Tbx4-LERGFP+细胞组成，另一个主要由Tbx4-LERGFP-细胞组成。此外，原代肺间质细胞和iPSC衍生细胞也显示出不同的聚类模式。
研究发现，iPSC衍生细胞在基因表达方面更接近原代肺间质细胞，并且在肺间质分化的早期阶段表达的基因特征还没有明显分化成成熟细胞。研究人员猜测并用实验证明，在肺间质分化过程中，一些GFP谱系追踪的细胞短暂地获得了肺间质祖细胞的状态，但随后失去肺特异性间质标记物的表达。他们通过实验证明，iLM 与 iLM Neg细胞中的一些标记物表达明显富集。iLM细胞和原代肺间质细胞中许多肺间质标记物的表达水平相似，但在一部分标记物的表达存在显著差异。此外，iLM细胞与对照组的一般间充质标记物的表达没有显著差异。这些结果表明，基于Tbx4-LER激活的iPSC衍生的工程肺间质具有类似原代胚胎肺间质的关键转录组特征。
最后，研究人员进行了共培养实验，证实了肺间质分化的重要时期（图2-3）。
图2
图3
图4
图5
图6
诱导肺间充质祖细胞具有发育能力
该研究尝试探索iLM细胞是否能够分化为更成熟的间充质系。他们将iLM 与 iLM Neg细胞分离并培养在平滑肌分化培养基中。结果显示，这两组细胞都能够向间质细胞方向发展，表达平滑肌标志物。然而，在侧板中胚层状态之后的定向肺间充质分化过程中，内皮细胞能力迅速丧失。这些结果与之前的研究相符，验证了iLM细胞具有不同分化潜力的观点。
诱导肺间质与工程化肺上皮细胞共培养形成三维类器官
该研究中，研究人员建立了肺上皮-间质共培养系统来研究iLM的功能能力。他们分别诱导分化了iLM 细胞和Nkx2-1+肺上皮祖细胞并将他们共培养。结果显示，iLM和肺上皮细胞在共培养后形成了三维类器官。此外，与单独培养的Nkx2-1mCherry+细胞相比，与iLM共培养在近端培养条件下显著提高了Nkx2-1mCherry+细胞的产量，而与MEF共培养则没有（图3）。
与诱导肺间质共培养会影响上皮分化程序
研究人员继续探究了与 iLM 共培养是否可能提供影响分化胚胎干细胞(ESC)衍生肺上皮细胞分子表型的信号，发现共同培养方式影响了上皮细胞的分化程序，使得肺上皮细胞保持在较不成熟的状态，表现出更高水平的早期肺上皮标记物，而更成熟的远端上皮谱系标记物表达水平较低。在近端分化条件下，与iLM共培养的细胞表达气道标志物增加，而 Nkx2-1 mCherry + 细胞中发育后期标记物减少。实验还发现，与iLM共培养可以部分补偿某些生长因子的去除。（图4、5a-c）。
共培养诱导非肺上皮祖细胞向肺上皮细胞分化
研究发现，在远端分化条件下，与iLM共培养能增加Nkx2-1mCherry+上皮祖细胞的数量和产量。研究者进一步尝试确定iLM是否能在ESC来源的内胚层培养中积极诱导肺上皮的发展。实验结果显示，在与iLM共培养之前，不论细胞是Nkx2-1mCherry+还是Nkx2-1mCherry-，任何Nkx2-1mCherry+细胞的肺上皮谱系标记的表达都无差异。此外，研究者还测试了iLM细胞的功能，实验结果表明iLM可以支持工程和原代肺上皮细胞的生长（图5d-i）。
共同培养中的上皮-间充质细胞相互作用影响间质细胞的分化
研究人员量化了共培养前后iLM细胞中肺间充质标志物的表达以及与 ESC 衍生的 Nkx2-1 mCherry + (Ch + ) 肺上皮共培养后MEF中的基因表达，发现在远端培养基中与Nkx2-1mCherry+肺上皮共培养，导致Wnt2、Tbx4、Pdgfra和Acta2仅在iLM中上调，而在MEF中没有上调，并且Col1a1表达在所有条件下均升高，而肺间充质祖细胞标志物Foxf1下调。研究还发现，共培养的iLM向间充质肺泡壁细胞和气道平滑肌细胞分化，而不是向血管平滑肌细胞分化。这些发现表明，在共培养中肺上皮细胞可能对维持、增强或成熟的iLM的肺特异性特征起着重要作用（图6）。
这项研究利用小鼠iPSC生成肺间充质祖细胞，发现它们具有与原代胚胎肺间充质相似的转录特征，并能成熟分化。研究人员还建立了类器官模型评估工程化肺间充质的功能能力，发现重组增强了肺上皮细胞的规格和产量，并对两个系的分子表型产生影响，表明了上皮和间充质之间存在功能性交叉。
综上所述，这项研究为肺发育和疾病研究提供了新的思路，并为治疗方法的开发提供了新的方向。
来源类器官学社
